Спиннинг-диск (Spinning-disk) микроскопия — Конфокальный микроскоп. Конфокальной микроскопии - Confocal microscopy Сканирующий конфокальный микроскоп спектра роман

В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r A = XY =0,6 λ/NA,

где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY c r =0,4 λ/NA,

где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z r =2 λ/NA 2 ,

где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.

Основные понятия

Хотя современные приборы значительно отличаются от самых ранних версий, принцип конфокального получения изображений, выдвинутый Марвином Мински и запатентованный в 1957 году, применяется во всех современных конфокальных микроскопах. В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство регистрации изображения или фотопленку. Метод же формирования изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение осуществляется сканированием всей поверхности образца одним или более сфокусированным лучом света, обычно от лазерного дугового источника. Освещенная область образца фокусируется объективом и затем сканируется с помощью сканирующего устройства с управлением через компьютер. Последовательность световых лучей от образца распознается через точечную диафрагму (или, в некоторых случаях, щелевую диафрагму) фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), выходные сигналы которого преобразуются в изображение, отображаемое на компьютере. Хотя неокрашенные образцы и можно наблюдать с помощью отраженного от них света, их обычно отмечают одной или более флуоресцентными красителями.

Способы получения изображения

При конфокальной микроскопии для исследования огромного количества образцов разного типа используются различные методы получения изображения. Все они основываются на технической возможности получения изображений высокой четкости, называемых оптическими срезами, в последовательности относительно толстых срезов или всего образца целиком (тотального препарата). Оптический срез является базовым элементом изображения. Сами изображения получаются при наблюдении связанных и окрашенных образцов в режимах одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения, формируемые с помощью различных методик освещения и окрашивания, будут точно соотнесены между собой. Возможно получение изображений живой клетки и развернутой во времени последовательности изображений (регистрация изображений в заданный временной интервал), а численные методы обработки, применяемые к последовательностям изображений, позволяют создать интегрированное целое изображение из серии изображений по оси z и трехмерные изображения образцов., а также представление трехмерных данных во временной последовательности, то есть четырехмерное изображение. В первых конфокальных микроскопах изображения получались с помощью отраженного света, но, в действительности, в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе может быть применен способ получения изображения с помощью любого источника проходящего света, обычно используемого в микроскопии.

Создание изображения

Процедуры подготовки образца и получения его изображения с помощью конфокальных микроскопов - это, в основном, те, которые были разработаны в течении многих лет в традиционной широкопольной микроскопии. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно окрашиваются одной или более флуоресцентными метками. Существует большое количество различных флуоресцентных красителей, которые могут быть занесены в относительно простые протоколы и использоваться для окрашивания определенных клеточных органелл и структур. Среди огромного множества доступных красителей имеются, например, красители ядра, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума, митохондрий, а также такие красители, как флуоресцирующий фаллоидин, указывающий на полимеризированный актин в клетках. Независимо от применяемого способа подготовки образца, главное преимущество конфокальной микроскопии заключается в гибкости способов представления и анализа изображения, являющейся следствием одновременного сбора множественных изображений и их представления в компьютере в цифровой форме.

Критические аспекты конфокальной микроскопии

Получение количественных трехмерных изображений во флуоресцентной микроскопии часто осложнено артефактами, возникающими при подготовке образца, благодаря контролируемым и неконтролируемым экспериментальным величинам или проблемам расположения и компоновки микроскопа. Эта статья, написанная доктором Джеймсом Б. Поли, систематизирует наиболее общие внешние факторы, которые часто «заслоняют» результаты, полученные в широкопольной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Среди обсуждаемых тем - лазерная система, юстировка оптических компонентов, увеличение объективов, артефакты, связанные с обесцвечиванием, аберрации, иммерсионное масло, толщина покровного стекла, квантовый выход (квантовая эффективность), и среда образца.

Аберрации в многоцветной конфокальной микроскопии

Усовершенствования конструкции упростили конфокальную микроскопию до такой степени, что она стала обычным инструментом проведения исследований в клеточной биологии. Но поскольку конфокальные микроскопы стали мощнее, стали предъявляться более высокие требования к их оптике. На самом деле, оптические аберрации вызывающие незначительные дефекты изображения в широкопольной микроскопии, могут привести к разрушительным последствиям в конфокальной микроскопии. К сожалению, строгие оптические требования в конфокальной микроскопии часто скрыты из-за оптических систем, гарантирующих четкое изображение даже в случае слабого микроскопа. Производители оптики выпускают множество различных объективов для микроскопов, предназначенных для определенных приложений. В этой статье показывается, какое влияние компромиссные решения при создании объективов оказывают на конфокальную микроскопию.

Трехцветная визуализация в конфокальной микроскопии

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) обычно используется для получения цифровых изображений флуоресцентных образцов, помеченных одной, двумя и тремя метками. Использование красного, зеленого и синего (RGB) цветов наиболее информативно для представления распределения света до трех флуоресцирующих меток клетки, когда для каждого взаимного расположения используется дополнительный цвет и когда изображения разного цвета образуют единую трехцветную картину. В этом разделе мы рассмотрим упрощенную версию недавно опубликованного метода получения трехцветных конфокальных изображений с помощью популярной программы обработки изображений, Adobe Photoshop. В дополнение, обсуждаются несколько приложений по созданию протокола трехцветного изображения для представления конфокальных снимков. Стоит иметь в виду, что эти численные методы не ограничиваются изображениями, полученными ЛСКМ, и могут применяться к цифровым изображениям, импортированным в Photoshop из других источников.

Основы конфокальной отражательной микроскопии

Конфокальная отражательная микроскопия может быть применяться для получения, дополнительной информации об образце, с относительно незначительными дополнительными усилиями, поскольку методики требуют минимальной подготовки образца и перенастройки оборудования. К тому же, в конфокальной отражательной микроскопии информация о неокрашенных тканях также легко доступна, как и данные, получаемые при работе с окрашенными образцами, отражающими свет. Этот метод можно также комбинировать с более распространенными методами исследований в свете флуоресценции. Примерами недавних приложений являются регистрация неокрашенных клеток в популяции флуоресцентно окрашенных клеток и наблюдение взаимодействий между флуоресцентно окрашенными клетками, растущими на непрозрачном структурированном субстрате.

Галерея конфокальных изображений

Галерея конфокальных снимков Nikon MicroscopyU представляет собой последовательность цифровых изображений, полученных с использованием конфокального микроскопа Nikon PCM-2000, объединенного с прямым микроскопом Eclipse E-600. Последовательность изображений оптических срезов в различных плоскостях образца была получена при сканировании вдоль оптической оси микроскопа. Последовательность представлена интерактивным Java - приложением, позволяющим либо «проигрывать» серию срезов автоматически, либо прокручивать их вперед и назад, как слайды.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

Было разработано несколько методов для преодоления явления плохого контраста, присущего изображениям образцов с большой толщиной, обычно создаваемым микроскопами. Конфокальная и деконволюционная методики создают существенно лучшие изображения образцов средней толщины (от 5 до 15 микрон). Изображения образцов с наибольшей толщиной (от 20 микрон и более) ухудшаются из-за воздействия большого потока внешнего света от внефокусных областей и, возможно, лучше всего получаются методами конфокальной микроскопии. С помощью этого учебного руководства образцы представлены сериями оптических срезов вдоль оси z с помощью виртуального конфокального микроскопа.

Отражательная конфокальная микроскопия

С помощью этого учебного руководства можно исследовать отдельные слои поверхности интегральных микросхем. Цифровые изображения для руководства были получены с помощью отражательного конфокального микроскопа Nikon Optiphot C200. Для каждой серии была записана последовательность оптических срезов по оси z, по мере проникновения и фокусировки микроскопа вглубь (с шагом 1 микрометр) мозаики схем на поверхности кремниевого кристалла.

Основные положения

По сравнению с традиционной, конфокальная микроскопия имеет несколько преимуществ, включая малую глубину проникновения в исследуемый образец, отсутствие фоновых засветок и возможность получать серии оптических срезов образцов большой толщины. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно отмечены одной или более флуоресцентными метками.

Рис. 1. Схема хода лучей в конфокальной микроскопии

При получении изображений флуоресцирующих образцов с помощью традиционного широкопольного микроскопа вторичное свечение, испускаемое образцом из областей вне исследования, часто влияет на четкость изображения деталей, находящихся в фокусе. Это особенно проблематично при толщине образцов более 2-х микрометров. Конфокальная микроскопия дает незначительное улучшение разрешения как вдоль оси, так и по плоскости; но именно возможность исключить фоновые засветки, возникающие во флуоресцентно-окрашенных образцах большой толщины, вызвала недавний всплеск популярности этого метода исследования. Будучи относительно простыми в управлении, большинство современных конфокальных микроскопов, стали частью базового оборудования во многих многопользовательских системах по работе с изображениями. Поскольку разрешение, достигаемое лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (ЛСКМ) несколько лучше традиционного широкопольного оптического микроскопа, но все же значительно ниже разрешения просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, он, в определенном смысле, явился мостом между двумя наиболее распространенными методами исследований. На рисунке 1 представлена принципиальная схема прохождения света в конфокальном микроскопе базовой компоновки.

В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство визуализации изображения или фотопленку. Метод же получения изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение образца осуществляется сканированием его одним или более сфокусированным лучом, обычно лазерным (рисунок 2). Изображения, получаемые сканированием образца, таким образом, называются оптическими срезами. Эта терминология относится к неинвазивному методу исследований, когда изображения получаются с помощью сфокусированного света, а не физическим рассечением образца.

Рис. 2. Широкопольное и точечное сканирование образцов

Конфокальная микроскопия значительно упростила исследование живых образцов, сделала возможным получение данных в трех измерениях (z-серия) и более совершенным процесс получения изображений мультиокрашенных образцов. На рисунке 3 сравнивается традиционное изображение, полученное при исследовании в свете флуоресценции с эпископическим осветителем с конфокальным изображением, одних и тех же участков тотального препарата куколки бабочки с эпителием, окрашенным иодидом пропидия. Очевидно впечатляющее повышение разрешающей способности и, как следствие, резкости изображения ядер на снимке ЛСКМ, благодаря исключению внефокусного флуоресцентного свечения.

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ)

ЛСКМ - сейчас наиболее распространенная версия конфокальных микроскопов, применяемых в биомедицине. Во введении особое внимание уделяется именно ЛСКМ, поскольку конструкция и устройство эти микроскопов позволяет работать с ними даже начинающим пользователям. Другие конструктивные решения заняли свои специальные ниши в биологии. Для любой модели Или модификации конфокального микроскопа применимо, с незначительными изменениями, большинство правил подготовки образцов, также как и для других методик, основанных на оптических срезах, таких как деконволюционная и многофотонная методики.

Развитие конфокальной микроскопии

Считается, что изобретение конфокального микроскопа принадлежит Марвину Мински, который создал рабочий микроскоп в 1955 году. Развитие конфокальной микроскопии было во многом вызвано желанием наблюдать биологические процессы в живой ткани (in vivo) (в организме), и Мински ставил перед собой цель получить изображение нейронной сети в неокрашенном препарате живого мозга. Принципы конфокальной микроскопии, выдвинутые Мински и запатентованные в 1957 году, применяются во всех современных конфокальных микроскопах. На рисунке 1 поясняется конфокальный принцип, в применении к эпифлуоресцентной микроскопии, положенный в основу всех современных конфокальных систем, используемых при получении флуоресцентных изображений. В первоначальной конфигурации Мински использовал точечное отверстие (диафрагму), помещенную напротив циркониевого дугового источника света, используемого в качестве точечного источника света.

Рис. 3. Эпителий крыла бабочки

Свет от точечного источника фокусировался в виде точки объективом на заданной фокальной плоскости в образце и, проходя через него, фокусировался вторым объективом на второй точечной диафрагме (точечном отверстии), находящейся в фокусе с первой (они являлись софокусными, т. е. конфокальными). Лучи, проходящие через второе точечное отверстие, попадали на фотоумножитель с низким уровнем шума, генерирующий сигнал в зависимости от яркости света, исходящего от образца. Второе точечное отверстие отсекало от фотоумножителя свет, идущий из областей выше или ниже фокальной плоскости в образце. Использование пространственной фильтрации для исключения внефокусного света и засветок при работе с образцами толще фокальной плоскости является ключевым принципом конфокальной микроскопии. В своих работах Мински также описывал отражательный микроскоп с одним объективом и дихроматическим зеркалом, конструкция которого стала основой используемых сейчас систем.

Чтобы получить изображение конфокальным методом, необходимо выполнить сканирование образца сфокусированным в точку светом. В оригинальном приборе, собранном Мински, луч света был неподвижен, а сам образец двигался на вибрирующем предметном столике. Неподвижность сканирующего луча относительно оптической оси микроскопа являлась преимуществом этой установки, так как это позволяла исключить большинство дефектов оптики, которые могли бы исказить изображение. Однако, при исследования биологических образцов это могло вызывать колебания и дисторсию, в конечном итоге, приводило к потере разрешающей способности и четкости изображения. Более того, при перемещении предметного столика и образца, невозможно выполнить никаких манипуляций, таких как, например, микроинъекции флуоресцентно окрашенных клеток.

Но, независимо от способа сканирования образца, необходимо получить его изображение. А первоначальная схема Мински не создавала действительного изображения, так как выходной сигнал фотоумножителя подавался на использовавшийся в вооруженных силах осциллограф с длительным послесвечением, не имеющий записывающего устройства. Позже Мински писал, что не слишком впечатляющее качество его изображения было следствием не низкой разрешающей способности самого микроскопа, но дисплея осциллографа. Сейчас понятно, что из-за отсутствия технологий Мински не мог в полной мере продемонстрировать весь потенциал конфокального метода, особенно при визуализации биологических структур. Он указывал, что быть может именно это стало причиной того, что конфокальная микроскопия не сразу была воспринята весьма требовательным сообществом биологов, для которых всегда было приоритетно качество получаемых изображений. В то время в их распоряжении были световые микроскопы с превосходной оптикой, позволяющие наблюдать и фотографировать цветные яркоокрашенные гистологические срезы на высокочувствительную цветную пленку. В современных конфокальных микроскопах изображение формируется из сигналов, поступающих с фотоумножителя или улавливаемых цифровой камерой со встроенным прибором с зарядовой связью, непосредственно обрабатывается компьютерной системой работы с изображениями, выводится на экран с высоким разрешением и на устройство документирования изображений превосходного качества. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа приведена на рисунке 4.

Рис. 4. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа

Эти технологии развивались независимо, и с 1955 года постепенно встраивались в конфокальные системы визуализации. Например, методы обработки цифрового изображения впервые были успешно применены в начале 80-х исследователями океанографического института Вудз Хоул (Woods Hole Oceanographic Institute). Используя, в их терминологии, «видео-микроскопы», они смогли получить изображения клеточной структуры микротрубок, размером меньше теоретического предела разрешающей способности оптического микроскопа. Очевидный рост разрешения стал возможен благодаря цифровой оптимизации изображений, захватываемых высокочувствительной суперкремниконовой (SIT) видеокамерой, соединенной с цифровым процессором изображений. Клеточные структуры были визуализованы с помощью оптики, работающей на дифференциальном интерференционном контрасте (ДИК), и дальнейшей обработки изображений цифровыми методами.

Классификация конструкций конфокальных микроскопов обычно основывается на методе сканирования образца. Существует два основных способа сканирования: сканирование предметного столика и сканирование осветительного луча; и, по крайней мере, два способа сканирования луча. В основу первоначального прибора Мински была положена система сканирования предметного столика, приводимая в движение примитивным камертонным генератором, которая создавала изображение довольно медленно. Современные конфокальные установки со сканированием предметного столика, ушедшие далеко вперед от своих прототипов, используются, в основном, в материаловедении, например, в производстве микрокристаллов. Системы, основанные на этом принципе, стали в последнее время популярны в областях биомедицины, где проводится анализ ДНК на микрокристаллах.

Более практичной альтернативой формирования изображений биологических систем является сканирование стационарного образца лучом. Этот принцип лежит в основе многих измерительных систем, усовершенствование которых привело к появлению популярных сегодня исследовательских микроскопов. В данном введении мы не касаемся технических деталей конфокальной микроскопии, но, по существу, в ней используются два принципиально отличных метода сканирования луча: многолучевое сканирование и однолучевое сканирование. Однолучевое сканирование на сегодня наиболее распространено, и именно этот метод применяется в ЛСКМ. Здесь сканирование луча производится с помощью управляемых компьютером зеркал, приводимых в движение гальванометрами со скоростью один кадр в секунду. Для достижения более быстрого сканирования, приблизительно с частотой видео кадров, в некоторых системах применяется акустооптическое устройство или колеблющиеся зеркала. В альтернативном методе используют два луча для сканирования почти в реальном времени, при этом обычно применяется разновидность вращающегося диска Нипкова. Эти системы явились результатом модификации и доводки спаренных (тандемных) сканирующих микроскопов (TSM), с целью создания более эффективных моделей для создания изображений флуоресцентно-окрашенных образцов. На рисунке 5 показана такая усовершенствованная система со спаренными дисками Нипкова и микролинзами для повышения чувствительности к слабому флуоресцентному свечению при создании изображения в реальном времени.

Рис. 5. Оптическая схема на основе дисков Нипкова

На сегодняшний день в конфокальной микроскопии существуют два альтернативных метода получения оптических срезов: метод деконволюции и многофотонный. Они различаются технически, но, как и конфокальные методы, основываются на традиционной оптической микроскопии. Деконволюция основана на вычислительных алгоритмах расчета и удаления той информации, которая поступает при создании изображения из внефокусных областей. Эта методика стала весьма удобной благодаря эффективным алгоритмам и высокопроизводительным миникомпьютерам. Многофотонная микроскопия использует ту же сканирующую систему, что и ЛСКМ, но не требует наличия точечной диафрагмы в приемнике. В ней нет необходимости, так как лазер возбуждает флуорохромную метку только в точке фокуса, исключая тем самым внефокусное излучение. При наблюдении живых тканей у этого способа появляются дополнительные преимущества, а именно: снижение фотообесцвечивания, поскольку уменьшается количество энергии, передаваемой лазерным лучом и поглощаемой тканями образца.

Традиционный оптический микроскоп представляет собой базу, на которой строится ЛСКМ. Вместо вольфрамовой или ртутной лампы применяется лазер, который связан с чувствительным фотоумножителем (ФЭУ) и компьютером, управляющим сканирующими зеркалами и другими сканирующими устройствами, а также облегчающим сбор и представление изображений. Полученные данные хранятся на цифровых носителях и могут быть обработаны с помощью многочисленных пакетов программ, либо на компьютере самой системы, либо на каком-нибудь другом.

По конструкции ЛСКМ, освещение и прием (регистрация) сигнала ограничиваются точкой на образце с дифракционным пределом. Объективы микроскопа сводят пятно освещения в фокус, и сканирующее устройство выполняет сканирование образца этим пятном под управлением компьютера. Сигналы от светящихся точек образца попадают в фотоумножитель через точечную (или, в некоторых случаях, щелевую) диафрагму, а выходные сигналы ФЭУ формируются в изображение и визуально воспроизводятся компьютером. Хотя неокрашенные образцы можно наблюдать в отраженном от образца свете, обычно они окрашиваются одной или более флуоресцентными красителями. Один из наиболее распространенных ЛСКМ, описанный в литературе примерно в 1990 году, был разработан в ответ на фундаментальную проблему, с которой столкнулись биологии-исследователи. Многие структуры и отдельные макромолекулы внутри иммунофлуоресцентно окрашенных зародышей невозможно визуализировать традиционным эпифлуоресцентным микроскопом после двухклеточной стадии, поскольку при возрастании числа клеток объем эмбриона остается примерно таким же. Это означает, что при более плотном расположении клеток усиливается свечение от клеток вне фокальной плоскости, что приводит к ухудшению разрешения изображения.

Рис. 6. Конфигурация лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon

Группа исследователей, работающих над этой проблемой, обнаружила, что ни одна из доступных в то время конфокальных систем не отвечает их требованиям. На то время микроскопы со сканированием предметного столика работали слишком медленно. На создание одного изображения уходило примерно 10 секунд, а приборы с многолучевым сканированием еще не подходили для флуоресцентной визуализации с практической точки зрения. ЛСКМ был разработан таким образом, чтобы удовлетворять требованиям традиционной эпифлуоресцентной микроскопии и, наряду с другими, разрабатываемыми в то же время, стал прообразом сложных систем, предлагаемых сейчас биомедицинскому сообществу различными фирмами. Пример применяемой сегодня системы (Nikon E1000) приведен на рисунке 6.

В специально разработанных приборах толщина оптических срезов может меняться с изменением диаметра точечного отверстия перед фотоприемником. В сравнении с другими конструкциями с фиксированным размером точечного отверстия эта дополнительная функция оказывается чрезвычайно гибкой при визуализации биологических структур. Изображение может быть увеличено без потери разрешения за счет сокращения сканируемой площади образца и помещения отсканированной информации в массив данных того же размера для хранения и визуального представления (подобным образом меняется увеличение и в сканирующем электронном микроскопе). Благодаря этому у одного объектива появляется интервал изменения масштаба, что может быть чрезвычайно полезным при визуализации редких или скоротечных событий, которые могут быть пропущены или потеряны при смене объектива.

Благодаря детально проработанным и гибким возможностям ЛСКМ, предлагаемых сейчас коммерческими фирмами по приемлемым ценам, в последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, когда многие многопользовательские лаборатории предпочитают это оборудование электронным микроскопам. Преимуществом конфокальной микроскопии является относительная легкость, с которой могут быть получены высококачественные изображения образцов, приготовленных для традиционной оптической микроскопии, и большое число приложений в различных областях исследований.

Первое поколение ЛСКМ хорошо работало с зафиксированными образцами, но им не удавалось контролировать световую энергию лазеров, что слишком часто приводило к фатальному разрушению живого образца, если не предпринимались серьезные меры предосторожности. Несмотря на эти ограничения, изображения зафиксированных образцов были настолько качественными, что конфокальный подход был безоговорочно принят специалистами. В приборах последующих поколений был усовершенствован каждый аспект процесса визуализации. В дополнение к этому, новые приборы стали значительно эргономичней и удобней в работе, так что юстировка, смена комбинации фильтров, регулировка мощности лазера, производимые с помощью компьютера, стали гораздо легче и быстрее. Сейчас возможно снимать изображения с тремя флуорохромами одновременно, а последовательно - с еще большим числом. Благодаря усовершенствованному и более надежному программному обеспечению, повышению быстродействия компьютеров, увеличению емкости дисков и падению цен на оперативные запоминающие устройства, процесс обработки изображения тоже значительно продвинулся вперед.

Режимы формирования изображения

Основным применением конфокального микроскопа является получение изображений толстых образцов различного типа. Преимущество конфокального метода проистекает из возможности создавать изображения образца как последовательность отдельных оптических срезов высокой четкости и разрешения. При этом используется несколько режимов визуализации; в основе каждого из них лежит оптический срез, как базовая единица изображения.

Рис. 1. Оптические срезы, меченные тремя метками

Отдельные оптические срезы

Оптический срез является базовой единицей изображения в методах конфокальной микроскопии. Могут быть получены изображения связанных и окрашенных образцов в режиме одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения мультиокрашенных образцов, будут совмещены друг с другом (если используются объективы с адекватной коррекцией хроматической аберрации). Дополнительное совмещение обычно производится методами цифровой обработки изображения. Большинству лазерных сканирующих конфокальных микроскопов (ЛСКМ) требуется примерно 1 секунда на получение оптического среза, хотя, обычно, изображения нескольких оптических срезов усредняются для улучшения отношения сигнал - шум. Время получения изображения, конечно, зависит от размеров изображения в пикселях и быстродействия компьютера системы. Для хранения типичного 8-битного изображения размером 768×512 пикселей потребуется около 0.3 Мбит памяти.

Представленные на рисунке 1 оптические срезы получены одновременно при облучении возбуждающим светом трех различных длин волн (488, 568 и 647 нанометров) при использовании одного криптонового / аргонового лазера в качестве источника излучения. В качестве образца представлен имагинальный диск крыла дрозофилы на третьей возрастной стадии, в котором помечены три гена, участвующих в формировании крыла. Три представленных гена и соответствующие флуорохромные метки таковы: (a) рудиментарный (флюоресцеин - 496 нанометров); (b) бескрылый (лиссамин родамин - 572 нанометров); и © CiD (цианин 5 - 649 нанометров). Комбинированное изображение трех пространственно представленных доменов генов, формирующих крыло, располагается внизу справа (изображение (d)).

Съемка в заданный временной интервал и визуализация живой клетки

Исследования живых клеток в заданный временной интервал приобрело новый импульс благодаря повышению разрешающей способности ЛСКМ. Ранее исследования движений клеточных структур проводились с использованием 16-миллиметровой фотопленки и интервалометром с часовым механизмом, соединенным с фотокамерой, позже с помощью видеомагнитофона с функцией цейтраферной съемки, оптического устройства записи на диск или платой оцифровки видеоизображений. Сейчас с помощью ЛСКМ можно получать оптические срезы через определенные, предварительно заданные интервалы в режиме реального времени.

Визуализация живых тканей с помощью ЛСКМ гораздо сложнее, чем получение изображения связанных образцов, и не всегда возможна практически, поскольку образец может не выдержать условий наблюдения. В таблице 1 приведены некоторые факторы, которые необходимо учитывать при наблюдении живых и связанных клеток с помощью ЛСКМ. Некоторые образцы просто физически невозможно поместить на предметный столик микроскопа, или они не смогут оставаться живыми на нем в течении всего периода наблюдения. Исследуемое явление или структура могут не попадать в поле зрения объектива. Например, имагинальные диски крыла дрозофилы развиваются слишком глубоко в личинке, поэтому их невозможно наблюдать; а после препарирования, они не могут развиваться в культуре. Поэтому сегодня единственный доступный метод наблюдать экспрессию генов в тканях такого типа - рассечь личинку, связать и окрасить имагинальные диски, взятые из образцов на разных стадиях развития.

Табл. 1. Наблюдение связанных и живых клеток с помощью ЛСКМ

Успешное наблюдение и создание изображений живых клеток требует чрезвычайной осторожности в течение всего процесса, Обязательным условием является поддержание приемлемых условий на предметном столике микроскопа. Повреждения, наносимые клетке при облучении лазерным лучом, могут накапливаться при многократном сканировании, поэтому это воздействие должно быть сведено к минимуму, необходимому и достаточному для получения изображения. В культуральную среду обычно добавляются антиоксиданты, например аскорбиновая кислота, для сокращения кислорода, выделяемого при облучении флуоресцентных молекул светом возбуждения, и способствующего образованию свободных радикалов, убивающих клетки. Обычно необходимо проводить всесторонние предварительные контрольные опыты для оценки влияния облучения на флуоресцентно окрашенные клетки, внимательно следя за соответствием всех параметров изображения проводимому наблюдению. Вслед за пробными изображениями необходимо оценить жизнеспособность живых образцов. Эмбрионы, например, должны продолжать свое нормальное развитие в течение всего процесса наблюдения, поэтому необходимо выявлять любые аномалии, вызванные воздействием облучения или флуорохромами. На рисунке 2 представлена съемка в заданный временной интервал эмбриона дрозофилы, флуоресцентно окрашенного зеленым кальцием. Серия снимков показывает изменение распределения флуоресцентного свечения во времени.

Каждый тип клеток требует своих мер для поддержания их жизнеспособности в процессе наблюдения. Для некоторых клеток насекомых достаточно поддержания комнатной температуры и наличия достаточно большого объема подходящей среды. Однако, большинство типов клеток требуют подогрева предметного столика и, иногда, перфузионной камеры для поддержания необходимого баланса углекислоты в течение их нахождения на предметном столике. Выбор типа клеток, для которых условия наблюдения с помощью ЛСКМ наименее «враждебны», поможет избежать многих экспериментальных проблем. Усовершенствования современных конфокальных приборов привели к существенному сокращению потенциальных проблем. Повышенная квантовая эффективность, большая числовая апертура (яркость) объективов и использование менее токсичных красителей для клеток привели к тому, что конфокальная микроскопия стала практичным методом анализа живых клеток. Необходимо стремиться к использованию лазеров меньшей мощности, позволяющих, в то же самое время, выполнять регистрацию и обработку изображений как можно быстрее. Если для ускорения сбора и регистрации изображений увеличивается апертура точечной диафрагмы (по сравнению с наблюдением неживых образцов), то последующая деконволюция может иногда восстановить потерянное качество снимка.

Рис. 2. Съёмка в заданный временной интервал

Многие физиологические процессы и события протекают слишком быстро, и поэтому не могут быть захвачены большинством ЛСКМ, скорость визуализации которых в среднем один снимок в секунду. ЛСКМ, использующие акустооптические устройства и щелевые диафрагмы, быстрее возбуждаемых гальванометром точечных сканирующих систем и более практичны для физиологических исследований. Эти более быстрые установки соединяют хорошее пространственное и временное разрешение, которое может достигать 30 кадров в секунду при полноэкранном разрешении, или быть близким к скорости видео изображения. В более медленных микроскопах, со сканированием через точечное отверстие, временное разрешение может быть увеличено только за счет уменьшения области сканирования образца. Если необходимо полное пространственное разрешение, частота кадров должна быть уменьшена, что ведет к потере временного разрешения. Конфокальные системы, в которых применяются сканирование диском или колеблющимся зеркалом, также способны визуализировать быстрые физиологические процессы или другие скоротечные события.

Z-серия и трехмерные изображения

Z-серия - это последовательность оптических срезов образца, выполненных на разных уровнях в плоскости, перпендикулярной оптической оси (z-ось). Z-серии изображений получаются путем согласования пошаговых изменений в тонкой фокусировке микроскопа с последующим получением изображения на каждом шаге. Пошаговое перемещение фокуса обычно выполняется шаговым двигателем под управлением компьютера, который изменяет фокус на заданную величину. С помощью макропрограммы компьютера можно получить и сохранить изображение, перефокусировать микроскоп на заданную глубину в образце, получить и сохранить второе изображение, опять произвести рефокусировку в новой плоскости и так далее, пока не будет получено запрограммированное число изображений.

Нужные изображения могут быть взяты из z-серии, полученной при съемке выбранной области образца и обработаны специальной программой для последующего детального исследования определенных клеток, представляющих интерес. Z-серия может быть представлена как фотомонтаж изображений, как, например, на рисунке 3. Этот тип комбинации и отображения изображений, а также многие другие операции с изображениями, входит в стандартный набор свойств современных пакетов программного обеспечения по работе с изображениями. Снимки на рисунке 3 являются выборкой из большей серии с еще более частым шагом по оси z. Зеленое свечение определяет периферийную нервную систему эмбриона дрозофилы, окрашенного антителом 22C10.

Рис. 3. Z-серия оптических срезов

По сериям из нескольких сотен оптических срезов образца, произведенных ЛСКМ, может быть трудно составить представление обо всем комплексе взаимосвязанных структур. Тем не менее, z-серия, после регистрации, является идеальным материалом для последующего трехмерного представления образца с помощью методик объемной визуализации. Этот подход сейчас повсеместно используется для прояснения отношения между структурой и функцией тканей в медицине и биологии. Важно задать правильный шаг z-сканирования образца определяемый шагом двигателя, изменяющего фокус; в этом случае снимок будет отражать действительную глубину образца.

До тех пор, пока образец остается неподвижным при его наблюдении, снимки z-серии, произведенной ЛСКМ, будут превосходно зарегистрированы, а сохраненные в цифровом формате, они будут относительно легко преобразованы в трехмерное представление образца. На рисунке 4 сравнивается отдельный оптический срез (a) с проекцией z-серии (b) и иллюстрируется ценность этой методики при визуализации периферийной нервной системы эмбриона дрозофилы, меченного антителом 22C10.

Шаг шагового двигателя, устанавливаемый оператором микроскопа, связан с толщиной оптического среза, но может иметь другое значение. Толщина оптического среза привязана к толщине среза образца, наблюдаемого в микроскоп, и зависит от объектива и диаметра точечной диафрагмы. В некоторых случаях, тем не менее, шаг фокуса может совпадать с толщиной оптического среза, и это может приводить к путанице.

Вслед за получением файла z-серии, его отправляют на обработку программой трехмерной реконструкции, специально разработанную для обработки конфокальных изображений. Такие программы обладают чрезвычайным быстродействием при использовании на графических станциях, но могут быть успешно использованы и на персональном компьютере или графической станции самого конфокального микроскопа, при достаточно быстром процессоре и наличии большой оперативной памяти. С помощью этих программ можно создавать как отдельные трехмерные представления образца, так и последовательность представлений, сменяющих друг друга, составленных по разным видам образца, что производит эффект вращения или других пространственных трансформаций и дает лучшее восприятие трехмерных свойств образца. Программа позволяет варьировать длину, глубину, производить объемные измерения, а также интерактивно менять специальные параметры изображения, такие как прозрачность образца, для выделения различных структур в разных уровнях образца.

Рис. 4. Оптический срез и проекция z-серии

Другой способ представления серии оптических срезов, взятых из последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал - это трехмерное представление, в котором ось z имеет функцию временной оси. Этот подход полезен при визуализации физиологических изменений при развитии организма. Примером применения этого метода было прояснение динамики изменения концентрации кальция в процессе развития эмбрионов морского ежа. Цветовое кодирование оптических срезов, взятых на разной глубине - простой способ представления трехмерных данных. На практике, цвет (обычно красный, зеленый или синий) приписывается каждому оптическому срезу, полученному на разной глубине образца, а затем цветные изображения объединяются, и за счет изменения цветов с помощью программы обработки изображений достигается желаемый эффект.

Получение четырехмерных изображений

С помощью ЛКСМ, динамические явления, проявляющиеся в живых тканях или в процессе подготовки живых тканевых культур и отраженные в последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал, могут быть представлены в четырехмерном виде, со временем в качестве четвертого измерения. Z-серии, полученные через определенные интервалы, представляют собой четырехмерные наборы данных: три пространственных измерения (x, y и z) и время, в качестве четвертого, что можно наблюдать с помощью программы 4D просмотра. Такие программы позволяют составлять и проигрывать как кинофильм, стереопары, взятые в разные моменты времени, или, альтернативно, обрабатывать и представлять воссозданные трехмерные изображения, снятые в разные моменты времени, как смонтированный фильма.

X-Z изображения

Если необходимо получить вид образца сбоку, как, например, вертикальный разрез эпителиального слоя, можно произвести x-z сечение одним из двух способов. Вид сбоку можно получить сканированием по одной линии образца (ось x) с разной глубиной (ось z), контролируя шаговым двигателем изменение фокуса, а затем объединяя всю серию срезов в единое изображение. Другим методом является использование опции плоскость разреза в программе воссоздания трехмерных изображений, когда вид сбоку выделяется из существующей z-серии оптических срезов. При формировании изображения эпителия крыла бабочки на рисунке 5, лазер сканировал по одной линии (горизонтальная черная линия на левом снимке) проникая в образец при разных значениях z-координаты, или глубины. X-z изображение, представленное на рисунке 5, было построено и представлено конфокальной системой визуализации. Эпителий крыла состоит из двух эпителиальных слоев, но, поскольку интенсивность флуоресцентного свечения падает с увеличением глубины проникновения лазерного луча в образец, четко визуализирован только верхний слой.

Рис. 5. Изображение в X-Z плоскости

Создание изображения в отраженном свете

Все ранние конфокальные микроскопы работали в отраженном, или обратно рассеянном свете. Используя отраженный свет, многие образцы в конфокальной микроскопии можно наблюдать неокрашенными, либо они могут быть помечены красителями с высокой отражающей способностью, как, например, иммунозолотом или микрокристаллами галогенидов серебра. Преимущество наблюдений в отраженном свете, особенно для живых тканей, состоит в том, что образец не подвергается фотообесцвечиванию. Но красители некоторых типов могут ослаблять лазерный луч. Другой потенциальной проблемой является то, что в некоторых микроскопах могут возникать внутренние отражения от оптических элементов на оптическом пути луча. Для многолучевых версий ЛСКМ и ЛСКМ со щелевой диафрагмой проблемы отраженного света не существует, а в тех микроскопах, где она есть, применение поляризаторов, визуализация областей без артефактов и смещение от оптической оси, помогают уменьшить проблему.

Создание изображений в проходящем свете

Любой из режимов визуализации в проходящем свете, обычно применяемый в микроскопии, может быть использован в ЛСКМ, включая фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), темное поле или поляризованный свет. Свет, прошедший через образец попадает на приемник проходящего света, сигнал которого, через волоконно-оптически й световод, направляется в один из фотоумножителей в сканирующей головке микроскопа. Изображения в проходящем свете и конфокальные эпифлуоресцентные изображения могут захватываться одновременно при использовании одного и того же луча от осветителя, что гарантирует их точную регистрацию. При объединении или синтезе изображений с помощью соответствующего программного обеспечения, может быть отражено точное положение меченых клеток в ткани. В некоторых исследованиях предлагается следующий содержательный подход: объединить неконфокальное изображение в проходящем свете с одним или более конфокальных флуоресцентных изображений меченых клеток того же образца. Такой подход позволит, например, определить пространственные и временные аспекты миграции субпопуляции меченых клеток в пределах популяции немеченых клеток в течение нескольких часов или даже лет.

Сегодня уже широко используется цветной приемник проходящего света, который принимает проходящие сигналы в красном, зеленом и синем цвете (RGB) для создания цветного изображения в реальных цветах, подобно тому, как это делается в некоторых цифровых цветных фотоаппаратах. Такой приемник особенно полезен для патологоанатомов, которые обычно наблюдают реальные цвета в тканях в проходящем свете и накладывают эти изображения на флуоресцентные данные для анализа.

Конфокальная микроскопия - один из современных методов исследования; позволяет проводить прижизненный мониторинг состояния роговицы с визуализацией тканей на клеточном и микроструктурном уровне.

Данный метод в силу оригинальной конструкции микроскопа и его большой разрешающей способности позволяет визуализировать живые ткани роговицы, измерить толщину каждого из её слоён, а также оценить степень морфологических нарушений.

Охарактеризовать морфологические изменения роговицы, возникающие при различных воспалительных и дистрофических её заболеваниях, а также вследствие хирургических вмешательств и воздействия КЛ.

Данные морфологического исследования необходимы, чтобы оценить тяжесть патологического процесса, эффективность лечения и определить тактику ведения больного.

Показания

Воспалительные заболевания роговицы (кератиты).
Дистрофические заболевания роговицы (кератоконус, дистрофия Фукса и др.).
Синдром «сухого глаза».
Состояния после хирургических вмешательств на роговице(сквозной пересадки роговицы, кераторефракционных операций).
Состояния, связанные с ношением КЛ.

Противопоказания

Относительное противопоказание выраженное раздражение глаза на фоне острого воспалительного процесса.

Подготовка

Методика

Исследование выполняют на конфокальном микроскопе ConfoScan 4 (Nider) с увеличением в 500 раз. Прибор позволяет осмотреть роговицу по всей её толщине.

Размер исследуемой зоны составляет 440x330 мкм, толщина слоя сканирования - 5 мкм. Линзу с каплей геля подводят к роговице до касания и устанавливают так. чтобы толщина слоя иммерсионной жидкости составляла 2 мм. Конструкция прибора позволяет исследовать роговицу в центральной зоне и её парацентральных участках (рис. 7-1; рис. 7-2.).

Интерпретация

Нормальная морфологическая картина роговицы

Передний эпителий состоит из 5-6 слоев клеток. Средняя толщина всего эпителия - приблизительно 50 мкм. По морфологической структуре выделяют следующие слои (изнутри кнаружи): банальный, шиловидных клеток и поверхностный.

Самый внутренний (базальный) слой представлен маленькими плотными цилиндрическими клетками без видимого ядра. Границы базальных клеток чёткие, яркие (рис. 7-3).

Средний слой состоит из 2-3 пластов шиповидных (крылатых) клеток с глубокими инвагинациями, в которые встраиваются выросты соседних клеток. Микроскопически границы клеток довольно хорошо различимы, а ядра могут не определяться или быть нечёткими (рис. 7-4).

Поверхностный слой эпителия представлен одним или двумя пластами полигональных клеток с чёткими границами и гомогенной плотностью. Ядра обычно ярче, чем цитоплазма, в которой также можно различить околоядерное тёмное кольцо (рис. 7-5).

Среди клеток поверхностного слоя различают тёмные и светлые. Повышенная отражательная способность эпителиальных клеток свидетельствует о снижении в них уровня метаболизма и начинающейся их десквамации.

Боуменова мембрана прозрачная структура, не отражающая свет, поэтому в норме при конфокальной микроскопии её визуализация невозможна.

Суббазальное нервное сплетение находится под боуменовой мембраной. В норме нервные волокна выглядят как параллельно идущие на тёмном фоне яркие полосы, контактирующие между собой. Рефлективность (отражательная способность) может быть неравномерной по протяжению волокна (рис. 7-6).

Строма роговицы занимает от 80 до 90% толщины роговицы и состоит из клеточного и внеклеточного компонента. Основные клеточные элементы стромы- кератоциты; составляют примерно 5% объёма.

Типичная микроскопическая картина стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел (ядер кератоцитов), которые лежат в толще прозрачного тёмно-серого или чёрного матрикса. В норме визуализация внеклеточных структур невозможна из-за их прозрачности. Строма может быть условно разделена на субслои: передний (расположен непосредственно под боуменовой мембраной и составляет 10% толщины стромы), переднесредний, средний и задний.

Средняя плотность кератоцитов выше в передней строме, постепенно их количество уменьшается по направлению к задним слоям. Плотность клеток передней стромы почти в два раза больше, чем клеток задней стромы (если плотность клеток передней стромы принять за 100%, то плотность клеток задней составит около 53,7%). В передней строме ядра кератоцитов имеют округлую бобовидную форму, а в задней овальную и более вытянутую (рис. 7-7.7-8).

Ядра кератоцитов могут различаться по яркости. Различная способность отражать свет зависит от их метаболического состояния. Более яркие клетки принято считать активированными кератоцитами («стрессовыми» клетками), деятельность которых направлена на поддержание внутреннего гомеостаза роговицы. В норме и поле зрения встречаются единичные активированные клетки (рис. 7-9).

Нервные волокна в передней строме роговицы визуализируются в виде ярких гомогенных полос, нередко образующих бифуркации (рис. 7-10).

Десцеметова мембрана в норме прозрачна и не визуализируется при конфокальной микроскопии.

Задний эпителий представляет собой монослой гексагональных или полигональных плоских клеток с равномерно светлой поверхностью на фоне чётких тёмных межклеточных границ (рис. 7-11).

В приборе заложена возможность мануального или автоматического подсчёта плотности клеток, их площади и коэффициента вариабельности.

Патологические изменения строения роговицы

Кератоконус характеризуется значительными изменениями в переднем эпителии и строме роговицы.

Передний эпителий. Обнаруживают различные варианты эпителиопатии (рис. 7-12).

История

В 50-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения меченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей . Для разрешения этой проблемы Марвин Минский , профессор в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент .

Принцип работы

Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом .

где длина волны излучения, - числовая апертура объектива, - показатель преломления среды между образцом и объективом, - половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51) Однако, в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3-10 нм .

Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе.

Изображение представляет собой двумерную (2D) картину.

См. также

Преимущества в биологии перед другими микроскопами

Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях - высота, ширина, глубина и время.

Примечания

Ссылки

• Molecular Expressions : Laser Scanning Confocal Microscopy
• Nikon’s MicroscopyU . Comprehensive introduction to confocal microscopy.
• Emory’s Physics Department . Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy - high res images also available.
• Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Конфокальный микроскоп" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. Микроскоп (значения). Микроскоп, 1876 год … Википедия

Атомно силовой микроскоп Атомно силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM atomic force microscope) сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от дес … Википедия

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

- (англ. nitrogen vacancy center) или азото замещённая вакансия в алмазе это один из многочисленных точечных дефектов алмаза. Дефект представляет собой нарушение строения кристаллической решётки алмаза, возникающий при удалении атома… … Википедия

В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Мински. В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Минский. Марвин Ли Мински англ. Marvin Lee Minsky … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Книги

• Конфокальная микроскопия и ультрамикроскопия живой клетки , Свищев Георгий Михайлович. Конфокальный микроскоп - это разновидность сканирующего светового микроскопа. При исследовании толстых объектов он дает изображения, свободные от фона, которые вобычных микроскопах создается…

Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

Конфокальную флуоресцентную микроскопию можно рассматривать как разновидность традиционной флуоресцентной микроскопии, которая позволяет исследовать внутреннюю микроструктуру клеток, причем не только фиксированных, но и живых, идентифицировать микроорганизмы, структуры клетки и отдельные молекулы, наблюдать динамические процессы в клетках. Конфокальная флуоресцентная микроскопия в дополнение к этому обеспечила возможность трехмерного субмикронного разрешения объекта и существенно расширила возможность неразрушающего анализа прозрачных образцов. Повышение разрешающей способности достигается благодаря использованию в конфокальных микроскопах лазеров в качестве источников света и конфокальной диафрагмы для фильтрации внефокусной флуоресценции. Преимущество лазеров по сравнению с ртутными или ксеноновыми лампами заключается в монохроматичности и высокой параллельности испускаемого пучка света. Эти свойства лазерного излучения обеспечивают более эффективную работу оптической системы микроскопа, уменьшают число бликов, улучшают точность фокусировки пучка света. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Конечно, при этом лазерный луч возбуждает флуоресценцию как в точке фокуса, так и во всех слоях образца, через которые проходит. И если эта внефокусная флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива, это ухудшает разрешение оптической системы. Избавиться от внефокусной флуоресценции позволяет конфокальная диафрагма. Изменяя диаметр конфокальной диафрагмы, можно определять толщину оптического слоя вблизи фокуса лазерного луча, поэтому флуоресценция, испускаемая выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и не регистрируется. Благодаря этому конфокальная микроскопия обеспечивает улучшенное разрешение, в первую очередь вдоль оси Z.

Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.

Благодаря улучшенному разрешению, особенно повышенному разрешению по оси Z, и возможности создавать серии «оптических» срезов, конфокальный микроскоп позволяет исследовать тонкую структуру объекта в трехмерном пространстве. Специальные программы позволяют создать из серии оптических срезов объемное изображение объекта (3D) и как бы рассматривать его под разными углами зрения, что может дать ценную информацию о форме клеток, цитоскелете, структуре ядра, хромосомах и даже локализации в них отдельных генов, а так же о взаиморасположении этих элементов.

Использование мультиспектрального (с несколькими флуорохромами) режима работы лазерного сканирующего конфокального микроскопа позволяет исследовать колоколизацию (пространственное взаиморасположение) в клетке двух или более разных веществ, например, белков, помеченных разными флуоресцентными красителями. Исследуя такие препараты в обычном флуоресцентном микроскопе, нельзя с уверенностью утверждать, находятся эти вещества рядом или одно под другим. С помощью метода оптических срезов и дальнейшей 3D-реконструкции объекта можно воссоздать объемное распределение веществ. Мультиспектральный режим так же позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования методом FISH.

Анализ интенсивности и формы спектров собственной флуоресценции позволяет распознавать нормальные и воспаленные клетки, и такой метод, в частности, предложен в качестве нового способа ранней диагностики шейки матки.

Подобрав комбинацию фильтров для нескольких типов собственной флуоресценции, возможно без проведения гистохимического окрашивания и трудоемкого получения и исследования множества срезов различать злокачественные и нормальные тканевые структуры в биопсийных пробах лимфоузлов пациентов с лимфоаденопатией различного происхождения.

Методы конфокальной микроскопии широко применяются в эмбриологии и гидробиологии, ботанике, зоологии при изучении структуры гамет, развития и формирования организмов.